分光光度计的原理介绍

　　分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源；

　　光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

　　核酸的定量

　　核酸的定量是分光光度计使用频率的功能。

　　可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的吸收峰的吸收波长260nm。

　　每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。

　　如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。

　　测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。

　　然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。

　　事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和度。

　　如EppendorfBiophotometer的准确度≤%（1A）。%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：

　　在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：

　　由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。

　　为了减少颗粒对测试结果的影响。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。

　　从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；

　　混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；

　　换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的小体积等多个操作事项。

　　除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260/A280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280nm。纯净的样品，比值大于（DNA）（RNA）。

　　如果比值低于，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。

　　A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A320一般是0。